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夾心ELISA實驗操作步驟
雙抗體夾心法，其基本原理是將一定量的包被抗體以物理吸附的方法固定于聚苯乙烯微孔板表面，加入無關蛋白載體封閉未結合位點，然后加入含有抗原之待測樣品，通過加入酶標記特異性抗體后用TMB底物顯色，微孔板中顏色的深淺與待測物的濃度呈正相關。該方法適用于測定二價或二價以上的大分子抗原，不適用于測定半抗原及小分子單價抗原，因其不能形成兩位點夾心。
一、實驗步驟
1.用捕獲抗體包被
①以捕獲抗體濃度為1-10μg/mL的碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液 (pH9.6)包被PVC微量滴定板的孔。
②未純化抗體（例如腹水液或抗血清）可能需要增加樣品蛋白質的濃度（嘗試用10μg/mL）補償濃度更低的特異性抗體。
③用粘合塑料制品覆蓋微量滴定板并在4℃下孵育過夜。
④棄去包被液，并洗滌微量滴定板兩次，每次在微孔中加入200μLPBS。在水槽上方輕輕甩動微量滴定板，除去溶液或洗滌液。在紙巾上輕拍微量滴定板，除去剩余的液滴。
2.封閉和加樣
①每孔添加 200μL 封閉緩沖液（5% 脫脂奶粉/PBS）封閉包被孔中剩余的蛋白質結合位點。
②用粘合塑料制品覆蓋微量滴定板并在室溫下孵育至少1-2小時，或在4℃下孵育過夜。
③用200 μL PBS洗滌微量滴定板兩次。
④將100 μL 稀釋樣品添加到每個孔。通常做法是比較未知樣品與標準曲線的信號。每板都必須測定標準品（兩重測定或三重測定）和空白樣品。37°C條件下孵育90分鐘。確保標準品濃度涵蓋抗體結合的大部分動態檢測范圍。可能需要優化濃度范圍以獲得合適的標準曲線。通常樣品和標準品采取兩重測定或三重測定。
⑤移除樣品，用200μL PBS洗滌微量滴定板兩次。
3.用檢測抗體和二抗孵育
①將100μL稀釋的檢測抗體添加到每個孔。確保檢測抗體識別與捕獲抗體靶蛋白的不同表位。這可防止對抗體結合的干擾。盡可能使用已測試的成對匹配抗體。
②用粘合塑料制品覆蓋微量滴定板并在室溫下孵育2小時。
③用PBS洗滌微量滴定板四次。
④添加100μL偶聯二抗，使用將其在封閉緩沖液中稀釋。
⑤用粘合塑料制品覆蓋微量滴定板并在室溫下孵育1-2小時。
⑥用PBS洗滌微量滴定板四次。
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